活细胞染料（例如CFSE）能够与胞内蛋白质形成共价结合，在细胞分裂过程中，染料会均匀分配至子代细胞，从而导致荧光强度逐代减半。借助流式细胞术检测荧光衰减，研究者能够追踪细胞增殖的代数。这一过程的具体步骤如下：

染料标记步骤

首先，T细胞需与CFSE（浓度为1-5μM）在避光条件下孵育10分钟。随后，使用冷培养基终止刺激，接着可选择抗CD3/CD28抗体或ConA进行激活，培养时间为48-72小时。流式细胞分析将用于检测荧光强度，通过FlowJo软件拟合分裂峰来追踪至少8代的细胞分裂。此外，这一方法兼容多色流式分析（如CD4/CD8/活化标志物的联用），动态反映增殖的异质性。

细胞毒性与应用场景

需要注意的是，高浓度染料可能具有细胞毒性，因此需要优化浓度。流式细胞仪的适用场景包括：基因修饰T细胞功能评估、免疫抑制剂动态药效分析及亚群增殖差异研究等。

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增殖细胞定量分析

在增殖细胞的DNA合成期，通过摄入胸腺嘧啶类似物（如BrdU或EdU）来定量增殖细胞比例。BrdU法需要在T细胞激活后加入BrdU（10μM）并孵育4-24小时，随后需要经过固定、酸/酶解及抗体检测的步骤。而EdU法较为推荐，因为它通过点击化学反应允许直接检测而无须使用抗体。

细胞增殖的代谢检测

增殖细胞的线粒体代谢增强，导致使用还原染料（如MTT/XTT）时生成有色产物，其吸光度（OD值）与活细胞数呈正相关。具体流程可选择MTT法或推荐的CCK-8法进行试验。

多重检测与方案建议

对于需要动态追踪亚群差异的实验，您可以使用CFSE分析增殖动力学（例如Th17与Treg的比较），而固定时间点增殖率检测可采用EdU来实现。若是进行高通量化合物筛选，推荐使用CCK-8（适用于96孔或384孔板）。为了更全面的分析，您也可以将CFSE与EdU双标记联用，从而同时分析分裂代数和S期细胞比例（需配置多激光流式设备）。

综上所述，掌握这三种方法的原理与优化要点，将有效覆盖大多数T细胞增殖研究需求，并为免疫机制探索及治疗开发提供精准的数据支持，推动生物医学的进展。